Медицина.

Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ,например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюлях. Лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Большие количества среды  (десятки и сотни литров ) готовят в специальных варочных котлах или реакторах. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 минут в 1 - 2 процентов растворе хлороводородной кислоты или погружают в этот раствор на ночь, после чего в течение часа прополаскивают в проточной воде.

(Посудой, предназначенной для приготовления сред, нельзя пользоваться в других целях, например для хранения химических реактивов или дезинфицирующих растворов - даже следы этих веществ могут помещать росту микроорганизмов.)

Исходным сырьем для приготовления большинства сред служат продукты животного или растительного происхождения : мясо и его заменители, молоко, яйца, картофель, соя, кукуруза, дрожжи и другие.

Основные питательные бульоны готовят на мясной воде или на различных переварах,полученных при кислотном или ферментативном гидролизе исходного сырья. Бульоны из переваров в 5 - 10 раз экономичнее, чем из мясной воды. Среды на переварах богаче аминокислотами, следовательно, питательнее; обладают большей буферностью, то есть имеют более стабильную величину pH. Кроме того, препараты можно готовить из заменителей мяса ( сгустков крови, плаценты, казеина и т. д.).

В настоящее время снабжение  лабораторий мясной водой и переварами централизовано. Чаще пользуются панкреатическим переваров Хоттингера, гидролизатами казеина или кормовых дрожжей. Из этих полуфабрикатов, по определенным рецептам, готовят необходимые среды.

Этапы приготовления сред : 1) варка; 2) установление оптимальной величины pH; 3) осветление; 4) фильтрация; 5) разлив; 6) стерилизация; 7) контроль.

Варят среды на открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах, подогреваемых паром.

Установление pH сред ориентировочно производят с помощью индикаторных бумажек. Для точного определения pH используют потенциометр.

Разливают среды в пробирки ( по 3 - 5 мл или по 10 мл ),флаконы, колбы, матрицы и бутылки не более чем на 2/3 ёмкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность. Среды, которые стерилизуют при температуре выше 100  ° С, развивают в чистую сухую посуду. Среды, стерилизуемые при более низкой температуре обязательно развивают в стерильную посуду.

Разливают среды с помощью воронки, на конец которой надета резиновая трубка зажимом Мора. Для мерного разлива  применяют мензурки, бюретки, дозаторы, шприцы, пипетки и т.п.
Посуду со средой обычно закрывают ватно - марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки. Важно, чтобы при разливе среда не смачивала края посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки. К каждому сосуду обязательно прикрепляют этикетку с названием среды и датой её приготовления.

Стерилизация. Режим стерилизации зависит от состава среды и указан в ее рецепте. Примерная схема режима стерилизации сред приведена в таблице.

Режим стерилизации сред.

Контроль готовых сред : а) для контроля стерильности среды ставят в термостат на 2 суток, после чего их просматривают. Если на средах не появятся признаки роста, их считают стерильными и передают для химического контроля по несколько образцов каждой серии;

б) химический контроль: окончательно устанавливают pH, содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов ( их количество должно соответствовать указанному  в рецепте).
Химический контроль сред производят в химической лаборатории;

в) для биологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами микроорганизмов, и по их росту судят о питательных ( ростовых ) свойствах среды. К готовой среде  прилагаю этикетку и паспорт, в котором указывают название и состав среды, результаты контроля и другие.

Хранят среды при комнатной температуре в шкафах, желательно специально для них предназначенных. Некоторые среды, например, среды с кровью и витаминами, хранят в холодильнике.

Рецепты приготовления простых ( основных ) сред и изотонического раствора натрия хлорида.

Изотонический раствор натрия хлорида.
К 1 литр  дистиллированной воды добавляют 9 грамм натрия хлорида. Раствор фильтруют, устанавливают заданный pH и, если нужно, стерилизуют при 120 °С в течение 30 минут.

Мясопептонный бульон ( МПБ ). К мясной воде прибавляют 1% пептона и 0,5% х.ч натрия хлорида, кипятят на слабом огне 10 - 15 минут для растворения веществ, устанавливают нужный  pH и снова кипятят 30 - 40 минут до выпадения осадка. Фильтруют, доливают до первоначального объема водой и стерилизуют 20 минут при 120 ° С.

Бульон Хоттингера. Перевар Хоттингера разводят водой  5 - 6 раз в зависимости от того, какое его колличество аминного азота он содержит и какое его колличество должно быть в бульоне ( указано в паспорте перевара и рецепте среды ). Например, для приготовления среды с 1,2 г/л аминного азота перевар, содержащий 9,0 г/л, надо развести в 7,5 раз ( 9,0 : 1,2 ). К разведенному перевару прибавляют 0,5 % натрия хлорида и кипятят на слабом огне до растворения соли. В остывшей среде устанавливают pH, фильтруют, разливают и стерелизуют 20 минут при 120 ° С.

Мясопептонный агар ( МПА ). К готовому бульону ( до стерилизации или после нее ) добавляют 2 - 3 процента    измельчённого агар-агара и кипятят, помешивая, на слабом огне до полного расплавления агара. МПА можно варить в автоклаве или аппарате Коха. Готовую среду, если нужно, осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 минут при 120 ° С. Полужидкий агар содержит 0,4 - 0,5 % агар-агара.

Питательный желатин. К готовому бульону прибавляют 10 - 15 % желатина, подогревают до его расплавления ( не кипятят ! ), разливают в стерильную посуду и стерилизуют текучим паром.

Рецепты приготовления сложных сред.

Среды с углеводами. К основному бульону или расплавленному агару прибавляют нужное количество ( 0,1 - 2 %) определенного углевода ( например, глюкозы ). После его растворения разливают в стерильную посуду и стерилизуют текучим паром. Поскольку углеводы частично разрушаются даже при таком режиме стерилизации, предпочтительнее 25 - 30% раствор углеводов, простерелизованный через бактериальный фильтр, добавлять в нужном объеме с соблюдением асептики к стерильным основным средам. После контроля стерильности среда готова к употреблению.

Среды с кровью готовят из стерильных простых сред, добавляя в асептических условиях ( лучше в боксе ) от 3 до 30% ( обычно 5% ) стерильной дефибринированной крови. Агаровые среды перед этим растапливают и остужают до 45% С. При нужной температуре должно быть терпимое ощущение горячего, но не ожога. После добавления крови, пока среда не застыла, содержимое сосуда тщательно перемешивают и разливают в чашки или пробирки.

Внимание ! Среды с кровью растапливать НЕЛЬЗЯ - кровь изменит свои свойства.

Среды с сывороткой крови готовят так же, как среды с кровью. К основным средам добавляют 10 - 20 % сыворотки, не содержащей консерванта и предварительно инактивированной при 56% С в течение 30 минут на водяной бане или в инактиваторе. При инактивации разрушается вещество ( комплемен ), губительно действующее на микробы.

Среды с желчью. К простым средам добавляют желчь в количестве 10 - 40 % объема среды, устанавливают нужный  pH и стерилизуют 20 минут при 120 ° С. Можно  стерильную желчь добавить к  стерильной среде в асептических условиях.

Разлив агаровых сред в чашки Петри.
Среды перед разливом расплавляют на водяной бане и  остужают до 45 - 50 ° С. Обычно для чашки диаметром 9 см достаточно 15 - 20 мл среды ( высота слоя 0,25 - 0,3 см ).Если слой выше, на нём менее контрастно выглядят колонии. При очень тонком слое резко ограничено количество питательных веществ и влаги ( среда быстро высыхает ) - ухудшаются условия культивирования.

Разливают среды в стерильные чашки в асептических условиях. Чашки ставят крышкой вверх. Сосуд со средой берут в правую руку, держа его у огня. Левой рукой вынимают пробку, зажав её мизинцем и ладонью. Обжигают горлышко сосуда и двумя пальцами левой руки слегка приоткрывают крышку. Вводят под неё горлышко флакона, не прикасаясь им к краю чашки. Наливая среду, следят, чтобы она равномерно распределилася по дну чашки. Если при разливе на поверхности среды образуются пузырьки воздуха, к ним до того, как среда застынет, подносят пламя спички или горелки - пузырьки лопнут. Затем чашку закрывают и дают среде застыть.
Если посев производят в день разлива, среду необходимо посушить. Для этого чашки в термостате осторожно открывают и устанавливают крышки и чашки открытой стороной вниз на 20 - 30 минут. Если посев производят на следующий день после разлива, чашки, не подсушивая, завертывают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали, и помещают в холодильник.

Приготовление скошенного агара. 
Пробирки с 4 - 5 мл стерильной расплавленной агаровой среды укладывают в наклонном положении  ( примерно под углом 20 °) с таким расчетом, чтобы среда не заходила за 2/3 пробирки, иначе она может смочить пробку. После того как среда застынет, пробирки ставят вертикально - дают стечь конденсату. Лучше употреблять свежескошенный агар.

Внимание ! Пользоваться средой, в которой нет конденсата, Нельзя. Ее следует снова растопить на водяной бане и скосить.